宏基因组学测序技术在成人医院获得性肺炎中的临床应用专家共识

医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia，HAP)是指至少在入院 48 h 后发生的肺炎，患者住院期间未接受有创机械通气、未处于病原感染的潜伏期，而于入院 48 h 后新发，是常见的医院获得性感染疾病。2018 年全国医院感染横断面调查报告显示，在 26 790例发生医院感染的患者中，共分离出医院感染病原菌11 965 株，其中来自下呼吸道标本最多，占 51.7% [1] 。据调查分析，美国急诊医院获得性感染的发生率为4.0%，其中最常见的感染是肺炎，占 21.8% [2] 。国内外研究结果均显示，HAP 在医院获得性感染中所占比例居首位 [3] 。与此同时，抗菌药物的不合理使用造成了医院耐药菌的产生，使得 HAP 诊断和治疗的难度增加，住院时间延长，医疗费用上升，发病率及病死率增高 [4-6] 。我国一项不同城市的教学医院对 HAP 临床调查的结果显示，HAP 患者的平均住院时间显著高于同期其他住院患者，其住院平均治疗费用亦显著高于同期呼吸科住院患者平均住院费用 [7] 。因此，快速诊断病原体及其耐药情况，及时恰当使用抗感染药物对于HAP 患者的诊疗和康复至关重要。传统的 HAP 病原微生物检测方法主要包括痰或支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的涂片、培养、核酸检测以及血清样本生物标志物的免疫学检测，这些方法无法满足临床需求，尤其是无法快速识别罕见或者未知的病原体 [8] 。

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宏 基 因 组 二 代 测 序 技 术 (metagenomics next generation sequencing, mNGS) 通过直接提取临床样本中的核酸进行文库构建和高通量测序，利用生物信息学算法分析样本中包含的病原微生物序列的种类及耐药基因和毒力基因，能够快速并且准确地检测各种临床样本中的病原微生物，显著提高病原检测的敏感性，大大缩短检测时间 [9-10] 。mNGS 检测范围广泛，能同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等，在罕见和新发病原体的诊断及溯源上具有显著优势；同时，mNGS 提高了肺部混合感染及真菌感染的诊断准确性，所以对于检测肺部感染病原体上具有重要作用和临床意义 [11-12] 。但mNGS 应用于临床尚有诸多问题需要解决，包括标本中人源污染影响低丰度微生物检出、生物信息学分析复杂、检测特异性略差、需专业人士进行结果解读等，特别是呼吸道本身存在大量定植菌，需结合流行病学和临床特征，综合评估检测结果是否为致病菌，使得临床医生和检验人员对临床结果进行正确判读具有一定的挑战性 [13-14] 。

mNGS 对于耐药基因的分析可以指导抗生素的使用。由于中国 HAP 的分布和抗生素耐药性数据有限，有研究分析了 2007—2016 年 15 家中国教学医院接受中国医院感染抗药性监测网络监测的 2 827 例 HAP成年患者的微生物检测结果，发现鲍曼不动杆菌(25.6%)、铜绿假单胞菌(20.1%)、肺炎克雷伯菌(15.4%)和金黄色葡萄球菌(12.6%)是最常见感染的病原体(其中多重耐药 MDR 患病率为 64.9%)；耐甲氧西林金黄色 葡 萄 球 菌 (methicillin - resistant staphylococcus aureus, MRSA)在 HAP 患者中感染率相对减少；耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌和产 ESBLs 肠杆菌科的感染率相对增加 [15-16] 。患者既往的抗生素治疗史是 HAP 的危险因素之一，大大增加患者的耐药菌感染风险，耐药菌的感染明显增加发病率和死亡率以及治疗成本，也伴随着更差的临床预后。传统微生物检测流程为培养、鉴定、药敏，存在周期长、漏检漏筛的问题。相比于药敏检测时间过长，mNGS 检测时间很短，且覆盖耐药基因范围广，故能快速识别抗菌药物耐药基因，对于及时治疗耐药菌感染以及限制耐药菌扩散有一定的临床意义。

为了促进和规范 mNGS 在医院 HAP 诊疗中的合理应用，促进病原体的诊断、正确判读检测结果，中国医学救援协会重症医学分会组织部分重症医学、呼吸病学、检验医学、急诊医学等相关领域的专家共同研讨并制定了本共识。本指南经过多次工作会议研讨，广泛征求国内相关领域专家意见，在遵循循证医学证据的基础上，经反复讨论，形成统一意见，经过多次修改，最终定稿。

1 检测流程

共识 1：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，最好采集支气管肺泡灌洗液或者气道抽吸物。

共识 2：

建议 HAP 患者如存在免疫功能低下、基础疾病严重或病情危重时，且在经济允许的情况下，进行微生物培养送检的同时开展 mNGS 检测。

1.1 样本采集 

用于诊断 HAP 的主要样本类型包括支气管肺泡灌洗液、痰液、咽拭子、肺穿刺组织等。样本采集最理想的时间是在第一次抗感染治疗用药前或下次抗感染治疗用药/更换其他抗感染治疗用药前，糖皮质激素的使用不影响 mNGS 检测结果。咽拭子主要用于上呼吸道感染病原体的评估判断，在HAP 患者进行咽拭子 mNGS 检查可以帮助临床医生了解患者口咽部的定植病原体，对于与吸入性因素相关的 HAP 患者感染病原体的判断有一定帮助。取样时应快速擦拭两侧腭弓和咽、扁桃体的分泌物或脓性物，避免触碰牙齿。患者有能力配合完成深部咳痰，采集痰液时应强调口腔清洁并深咳，以避免口咽部菌群污染。有气管插管(tracheal intubation)或气管切开(tracheotomy)等人工气道患者，无法自行咳痰，可通过吸痰管从气道吸痰获得标本。对于不能进行深部咳痰的患者可采集支气管肺泡灌洗液进行检测，以减少口咽部菌群的污染，提高检测结果的准确性。采集支气管肺泡灌洗液对操作技术要求相对较高，建议有经验的医师进行操作 [17-18] 。通过非创伤性样本检查未能明确病原体诊断的情况下，可考虑经皮肺穿刺，肺穿刺组织的 mNGS 可能获得阳性结果 [19] 。气道抽吸物适用于在 ICU 中机械通气的患者，通过患者气管内管道靶向吸出，不涉及肺泡空间 [20] 。所有采集的样本都应确保合格，并进行合理的运输。呼吸道感染病灶推荐优先级为支气管肺泡灌洗液>气道抽吸物>诱导痰>深部痰/肺组织 [21] 。采集体积最少 3 mL，无菌管保存，冷藏或者干冰保存，72 h 内送达实验进行 mNGS 检测。

共识 3：

在流感病毒、冠状病毒等 RNA 病毒流行期间，建议 HAP 患者开展宏基因组检测时，首选 DNA和 RNA 检测项目。

1.2 样本预处理 

出于生物安全考虑，在核酸提取前应对样本进行 56℃下 30 min 的灭活 [22] ，灭活处理后，按样本类型进行预处理，支气管肺泡灌洗液可直接混匀或离心后取沉淀进行核酸提取；粘稠的痰液需要加入 DTT/NaOH/胰酶等试剂进行液化处理；咽拭子振荡后将病原体洗脱进保存液，弃去拭子；肺组织/气道抽吸物样本使用胰酶/组织匀质仪等方法进行组织破碎和匀浆。为提高胞内菌、真菌等的检出率，提取前应对样本进行破壁处理，目前常用的破壁方法有酶法、化学法和珠磨法 [23] 。多数临床标本(支气管肺泡灌洗液、痰液)由于存在大量的宿主细胞或宿主的游离核酸，病原微生物在提取出的核酸样本中的丰度通常极低 [24] ，为了提高 mNGS 的检测灵敏度，可以结合临床检测需求，进行人源核酸的去除。尤其是支气管肺泡灌洗液、痰液样本，其人源细胞占比较高，考虑实验操作的简便性，建议采用差异裂解的方式去除人源宿主核酸。该方法主要是基于人源细胞比微生物外壳更脆弱，首先使用温和的去污剂裂解宿主细胞释放 DNA，再用其他酶降解人源 DNA 的去污剂处理，从而实现保留微生物核酸、清除宿主核酸的目的 [25-27] 。

1.3 核酸提取 

核酸提取方法根据检测项目是 DNA还是 RNA，或者 DNA 和 RNA 共检测而不同，DNA 和RNA 共检测可以避免 RNA 病毒的遗漏。核酸提取方法还存在不同提取试剂盒、手动提取或自动提取的差异。为不影响下一步实验，核酸的质量与纯度需满足下游实验要求，核酸质量一般需大于 1 ng，DNA 的纯度 OD 260/280 在 1.8 左右，OD 260 /OD 230 ＞2.0；RNA 的纯度OD 260/280 在 2.0 左右，OD 260 /OD 230 ＞2.0。

共识 4：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，要求相关实验室测序数据量至少保证 10 M 以上。

1.4 文库构建

文库制备是将基因组 DNA 片段化，并在片段末端连接测序所需要的寡核苷酸接头的过程。常见的二代测序文库构建方法主要有连接酶建库和 Tn5 转座酶建库，尽可能选用操作简单、步骤较少的建库方法，有利于降低实验背景污染。文库的质量影响检测结果，因此在文库构建过程中应设立明确的文库合格标准(文库浓度、片段大小等)，文库浓度一般大于 1~2 ng/μL，文库的插入片段在 100~300 bp，则满足各二代测序平台的测序上机要求。

1.5 上机测序 

主流的二代测序平台有：Illumina 的HiSeq、NovaSeq 系列平台，Thermo Fisher 的 Ion S5、Proton 平台，华大智造的 BGISEQ-500、MGISEQ-2000平台，Genapsys 的 GS111 平台等；三代测序平台有：PacBio 的 CCS 平台、Oxford Nanopore 的 PromethION、MinION、Flongle 平台等。测序后获得原始 reads 数据，存储格式通常为 fasta 或 fastq 文件，其中 fastq 包含碱基质量信息，可供后续生物信息学分析使用。测序平台的测序长度为 50～600 bp，二代测序的读长一般是在 50～400 bp，例如：华大测序读长为 50 bp，Illumina 测序读长为 75 bp，Thermo Fisher proton 测序读 长 为 150 bp，Thermo Fisher Ion S5 测 序读长为400 bp，三代测序的平均测序读长为 3.2 Mb。对于复杂的宏基因组样本，Illumina MiSeq、Thermo Fisher IonS5、Oxford Nanopore MinIon 等所有平台都能够进行检测，并且识别混合物中的所有菌株，但不同平台对微生物基因突变的捕获水平差异较大，Thermo Fisher 的测序读长相对更长，对于检测基因组的错误率更有优势。测序数据量至少为 10 M reads(1 000 万条核酸序列)，如湿实验包含人源核酸去除，将病原微生物基因的丰度提高，则数据量低于 10 M reads 可能满足设计要求，但仍需充分验证 [28-29] 。

共识 5：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，临床检测报告中要体现内参和对照品的检测合格性。

1.6 内参及对照品 

每批次实验都应包含内参、阴性和阳性对照品，以达到质控全过程的作用。内参包括噬菌体、提取的核酸或合成的 DNA 和 RNA 片段等，可以帮助量化原始样本，监测整个实验流程。阴性对照品主要用人源的宿主细胞模拟，如 Hela 细胞等，可以监测外部或试剂微生物污染和样本交叉污染，但由于是细胞培养，故不排除存在支原体的污染。阳性对照品包括每一种要检测的微生物类型中的至少一种，如病毒、细菌、真菌和寄生虫等。阳性对照有助于监测每类微生物的核酸提取、文库构建、生物信息学分析过程 [30] 。

共识 6：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，检测结果要结合基础疾病史、临床其他检测结果综合考虑。

1.7 生物信息学分析 

生物信息学分析的过程包括在分析前对下机数据进行质量控制，去除非测序序列、低质量序列、过短长度序列、重复序列、低复杂度序列，然后与人类基因组和参考微生物基因组比对，去除人类参考基因组序列，再与微生物基因组比对并进行下游的分析，包括耐药基因、毒力基因等。为了缩短分析时间，提高分析准确性，需要在速度和精度做重点优化；除此之外，在计算资源、能耗、体系结构等方面也存在着优化空间 [31] 。目前，国内尚无经国家药品监督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)批准的第二类医疗器械 mNGS 生物信息学分析专用的标准数据库。现有国内 mNGS 实验室的数据库主要为自建数据库，广泛收集公共数据库的参考基因组，进行挑选、整理并分类，采用专业软件将收集到的基因组序列整理成本实验室特有人源及微生物序列比对数据库，并且进行定期的维护和更新；或者为检测系统配套数据库，相对稳定，实时更新，但微生物数量较少。不同的数据库和生物信息软件都需要经过临床标本的测序数据的性能确认，包括精密度、准确度、最低检测限、分析特异性和可报告范围 [32] 。

1.8 出具报告 

报告出具过程中应参考疑似背景微生物库及阴性对照检测结果，尤其是呼吸道定植菌，并结合所提供的临床信息，最终给出检测报告。检测报告应包括检出序列数、基因/基因组覆盖度和相对丰度等内容，其概念如下：

检出序列数：所得文库在高通量测序设备上进行测序，得到的碱基序列称为序列，检出序列数通常为检测到该物种属或种的特异序列条数。

基因/基因组覆盖度：将比对上的参考基因/基因组的总长平均切分为 100 个区间，统计每一区间的检出序列数，再计算基因/基因组比对上的序列碱基数覆盖的区间占比，即得到覆盖度。

相对丰度：注释到该物种的序列数占样本中所有微生物总序列数的百分比。

2 mNGS 报告解读规则

mNGS 阳性阈值受到多种因素的影响，如测序平台、测序流程、测序数据量、样本类型、病原种类、患者情况等。目前，不同实验室结合实验与临床，确定出了不同的阳性阈值。对于感染病原微生物的判断还要考虑其在参考基因组的覆盖度，覆盖度越大，可信度越高。mNGS 的结果代表临床标本中检出某微生物的核酸片段，不能明确该物种与感染的关系，所以需要结合临床考虑 [33-34] 。主要为 mNGS 检测结果与临床信息相结合进行临床判读，临床信息库包括病原微生物感染后的疾病症状知识库、医学检验报告知识库、影响检查报告知识库、耐药数据库、流行病学知识库、感染因素知识库等。

2.1 阳性结果的解读 

共识 7：

建议 HAP 患者开展mNGS 检测时，如检测到多种细菌时，需要考虑混合感染，同时结合临床表现综合考虑主要感染源。

2.1.1 一般细菌。

外源性病原体常以气溶胶或凝胶微粒等形式通过吸入进入下呼吸道。据 2021 年CHINET 中国细菌耐药监测结果，301 917 株呼吸道标本分离菌中主要菌种分布，排名前 10 位的分离菌有：肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、阴沟肠杆菌、卡他莫拉菌。自 2017 年起，肺炎克雷伯菌在呼吸道标本中的分离率超过鲍曼不动杆菌，上升至第 1 位 [35-36] 。对于这些条件致病菌的判断，需要结合检测序列数、基因组覆盖度、相对丰度、毒力基因、患者临床信息等进一步解读。

共识 8：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如检测到毒力基因，需要重点考虑高毒力肺炎克雷伯菌，如检测到耐药基因，避免使用耐药基因对应的抗生素，但可以通过药敏试验对耐药基因进行验证。

2.1.2 毒力基因及耐药基因。

mNGS 中对毒力基因下游分析有利于提高对病原感染可能性的判定。如高 毒 力 肺 炎 克 雷 伯 菌 (hypervirulent Klebsilla pneumoniae，hvKP)，血清型主要包括 K1、K2；与高毒力相关的毒力基因包括 [35] ：①荚膜多糖合成和合成调控相关基因 wcaG 和 magA 、 rmpA 、 rmpA2；②脂多糖相关基因 wabG 、 uge；③铁摄取系统相关基因 aero 、kfuBC 、 ybtA 、 iucB 、 iutA 、 iroNB；④尿素酶相关基因 allS、ureA 等 [37] 。

对耐药基因的下游分析有助于指导医生用药，减少耐药性毒株的发生。随着抗菌药物的不合理使用，常见条件致病菌耐药情况越来越严重，应及早进行病原菌检测并采取有效预防和控制措施，防止医院感染发生和暴发。下面介绍几种常见院感菌的耐药基因情况。

肺炎克雷伯菌主要通过产生超广谱内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases, ESBLs)进而对 β-内酰胺类抗菌药物产生耐药，相关基因型主要包括SHV 、 TEM 、 CTX-M 、 OXA [38] 。碳青霉烯耐药主要由于碳青霉烯酶的产生，其相关基因主要有 A 类碳青霉烯酶基因(blaKPC-2 、 blaSME-2)、B 类碳青霉烯酶基因(blaNDM-1 、 blaIMP- 4 、 blaVIM-1)、D 类碳青霉烯酶基因 (blaOXA - 48)、孔 膜 蛋 白 类 基 因 (blaOmpK-35 、blaOmpK-36 、 blaOmpK-37)。质粒介导的多粘菌素耐药基因 mcr-1 是肺炎克雷伯菌对多粘菌素产生耐药的重要机制之一 [38] 。

鲍曼不动杆菌的氨基糖苷类药物耐药与 aac(3)-Ⅰ 、 ant(3″)-Ⅰ 、 aac(6')-Ⅰ 、 armA 基因有关，氟喹诺酮类药物耐药与 gyrA 基因突变有关，β-内酰胺类耐药与OXA-23 、 OXA-24 、 OXA-58 有关 [39-41] 。

泛耐药菌(pandrug-resistant bacteria，PDR)铜绿假单胞菌耐药为多重机制，主要与 7 种耐药相关基因[(blaTEM 、 blaOXA10 、 oprD2 缺失、aac(6')-Ⅱ 、 aac(3)-Ⅱ 、 qacE△1-sul1 和Ⅰ类整合子]有关 [42] 。

金黄色葡萄球菌容易对抗菌药物产生很高的耐药性，MRSA 是 HAP 和呼吸机相关性肺炎(VAP)的常见原因。MRSA 肺炎与患者的发病率和死亡率相关，MRSA 较甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive staphylococcus aureus, MSSA)的耐药性更高、更复杂 [43] ，多数 MRSA 菌株存在 β-内酰胺类(mecA)、四环素类(tetM)、氨基糖苷类[aac(6')-aph(2″)]等多种抗菌药物耐药基因 [44-46] 。

嗜麦芽窄食单胞菌对 β-内酰胺类药物耐药与产β-内酰胺酶 L1、L2 型基因有关，对喹诺酮类药物耐药与 qnr 基因有关 [47] 。

肺炎链球菌的 β-内酰胺耐药性主要是产生 β-内酰胺酶和青霉素结合蛋白编码基因 PBPs 的突变；大环内酯-林可酰胺-链阳菌素 B (MLS) 抗生素是普遍应用于治疗葡萄球菌和链球菌的抗菌药物，大环内酯耐药性肺炎链球菌的耐药表型的 MLS 型，M 型分别由耐药基因 ermB 和 mefA 介导 [48-49] 。

共识 9：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如患者为严重的粒细胞减少或严重的细胞免疫缺陷继发HAP 时，除重点关注一般细菌外，真菌、病毒和胞内菌等机会性感染也需重点关注。

共识 10：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如检测到嗜肺军团菌，需要考虑是否存在院内供水污染等情况。

2.1.3 胞内菌。

胞内菌分兼性和专性两类。兼性胞内菌可以寄居在宿主细胞内，也可以在体外无活细胞的适宜环境中生存和繁殖。常见的兼性胞内菌包括：分枝杆菌、嗜肺军团菌、布鲁氏菌、单核细胞增生李斯特菌等 [50] 。专性胞内菌有衣原体、立克次体等。由于胞内菌的释放相对困难，mNGS 对于胞内菌的报出阈值为检出即可报阳。为确保其准确性，应进行人工序列比对再次确认。此外，有报道军团菌和分枝杆菌感染可由医院供水污染引起，因此在检出时需要考虑是否出现了院内供水污染 [51] 。

共识 11：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如检测到支原体和衣原体，需要考虑是否存在院内污染。

2.1.4 衣原体和支原体。

这类病原体在 HAP 重症患者中的发生率低。2013 年 1 月—2017 年 5 月，在耶拿大学医院选取 314 例患者发现 HAP 重症患者的肺炎支原体阳性率为 0.6%，未检测到肺炎衣原体 [52] 。

共识 12：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如检测到常见的口腔定植菌，需要考虑是否存在机械通气和误吸等情况。

2.1.5 口腔定植菌。

支气管肺泡灌洗液中有大量的口腔定植菌时，首先考虑取样是否存在污染，其次结合患者情况考虑是否由于误吸(aspiration)引起的感染。口腔定植菌多以误吸的方式进入下呼吸道。在院患者在抗菌药物暴露、留置胃管等危险因素作用下，导致口腔正常菌群改变，加之气管妨碍会厌关闭，造成含定植菌的口咽分泌物下移，通过会厌或气管插管进入下呼吸道，引起感染。机械通气患者感染 HAP 与其牙菌斑和口腔定植菌有关 [53] 。口咽部和上呼吸道定植菌的误吸是 HAP 最常见的病因。下呼吸道样本中厌氧菌检出率高，表明口腔中厌氧菌的“误吸”可能是混合感染的原因之一。口腔定植菌感染的判定需根据患者情况、检出序列数、相对丰度等判定。

共识 13：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如患者有持续性严重的免疫缺陷症如艾滋病、中性粒细胞减少症等，检测到真菌且针对用药无效时，需要结合流行病学情况等考虑真菌耐药的可能。

2.1.6 真菌。

肺部真菌感染多发生于免疫功能受损、中性粒细胞减少以及长期使用广谱抗生素的患者，总体预后差、治疗难度高、病死率高。曲霉属(如烟曲霉等)、念珠菌属(如白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌等)是常见的病原菌，此外还有新生隐球菌、耶氏肺孢子虫等。曲霉菌在室内和室外环境中十分常见，并且经常出现在堆肥堆、通风口和空气传播的灰尘中，在院内可能会与医院建筑施工传播的灰尘和空气尘埃污染有关。通常曲霉感染多经吸入孢子引起，免疫系统薄弱的患者感染可能性更大。呼吸道样本检出念珠菌属表明有定植，不一定是肺炎 [54] 。真菌细胞壁厚，检出即报阳，但是否感染仍需结合临床进行诊断。中国医院侵袭性真菌监测网 CHIF-NET2019 年度研究报告提示，应重点关注热带念珠菌唑类耐药以及念珠菌属棘白菌素类耐药情况的发生 [55] 。对于真菌的耐药，目前还没有成熟的数据库，实验室可根据实际情况自建真菌耐药数据库进行检测。

共识 14：

建议 HAP 患者开展 mNGS 检测时，如检测到常见的呼吸道相关病毒时，结合该病毒流行病学情况，同时关注患者是否存在流行病学接触史，参考血清 IgM 抗体和 IgG 抗体的情况综合考虑。

2.1.7 病毒。

流感病毒(IV)、副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)也可在免疫低下的患者中引起HAP。怀疑患者为混合感染的情况下应进行病毒的检测，包括 RNA 病毒。这些基因组序列显著区别于人类基因组的病毒，检出即可报阳。

共识 15：

建议 HAP 患者开展 mNGS 时，如果检测结果为阴性，可以针对临床可疑的微生物进行 PCR 验证，同时阴性结果对于排除感染具有较好的阴性预测意义，但需要结合其他检测结果综合考虑。

2.2 阴性结果的解读 

在标本采集合格、运输规范的前提下，呼吸道感染标本较易检出病原微生物。对于阴性报告，需要结合患者的情况进行具体分析，一方面考虑患者是否已不存在感染性疾病；另一方面，明确送样前患者是否已经进行抗感染治疗用药，再根据具体的临床信息，判断低于报出阈值的致病菌是否有可能为患者感染病原菌。如不能排除感染，检测结果又没有符合临床的病原菌，可以考虑是否为胞内菌感染，如结核分枝杆菌、嗜肺军团菌等，又或者是 RNA 病毒感染。由于 mNGS 对这些病原微生物的检测限相对较高，在微生物含量低于检测限的时候，mNGS 无法检测。为减少 mNGS 检测中由 RNA 病毒或者混合感染引起 HAP 的假阴性结果，改善患者预后，除了检测DNA 可加做 RNA 病毒检测项目，或者进行 DNA 和RNA 共检测。

3 mNGS 在 HAP 中的应用展望

由于 mNGS 的高敏感度能够得到样本中的所有微生物，一次性检测囊括了样本中正常微生物群、瞬时定植菌、样本污染和/或病原微生物，如何区分感染病原与定植菌群是关键性的难题。而定植菌群受到人群和临床差异的影响，故根据大样本建立人群的基线尤为重要，可以在未来重症感染疾病诊断和治疗当中，建立个人微生态档案，进行用药指导，及时提供病原体信息和诊断依据。

3.1 宿主免疫应答 

对于免疫功能健全的人群，肺部感染后免疫系统迅速应答，产生促炎或抗炎反应，若免疫平衡，患者很快康复；当免疫应答过度激活时，患者会出现强烈炎症反应，出现发热、高动力性循环，甚至细胞因子风暴和休克。然而，在 HAP 患者中，正常的免疫平衡往往被打破，进而导致难以治愈的慢性和持续性感染，或具有高病死率的高炎症综合征、高炎症休克。肺部感染后的宿主免疫应答是病原微生物和宿主免疫系统相互作用、相互协调的结果，宿主自身免疫系统的异质性和感染微生物的差异都会影响重症肺炎的发生与发展。但对于同种病原微生物造成的感染来说，激发的宿主免疫应答必然存在一定的内在规律，了解特定病原在人体内的免疫应答规律将有助于在临床上建立同类病原感染肺部后的免疫诊断和治疗的模式 [56] 。呼吸道微生物参与呼吸生理和免疫稳态的成熟和维持，在感染期间或者疾病期间，呼吸道微生物系统发生改变，宿主和微生物之间的平衡就会受到干扰，从而使得宿主整体的健康受到威胁，临床上可通过宿主-微生物-代谢轴研究分析微生物及其代谢物对宿主代谢的影响，辅助加深对于感染后代谢变化的理解 [57] 。mNGS 检测可通过 DNA 及 RNA 检测分析确定不同类型病原微生物所触发的宿主免疫反应，可以为 HAP 的诊断带来帮助。

3.2 科室病原谱 

HAP 与院内定植菌存在很大的关系，而不同科室存在不同病原谱，故设计不同的病原谱靶向测序大大降低了检测费用，同时可以作为患者筛查和监控的技术方案。另外，病原体靶向测序技术(ptNGS)使用大量针对目标病原体的探针，对样品中的核酸进行多重 PCR 扩增，再通过高通量测序对这些扩增产物进行测序分析，实现对病原体的定量分析，很好地结合了 PCR 技术的高灵敏度以及高通量测序的高特异性，有望成为一项灵敏度及特异性兼备的检测技术。

3.3 床旁监测 

mNGS 检测模式目前主要是在第三方实验室集中进行检测，需要将标本寄送到指定实验室，转运时间将花费整个检测周期一半的时间。而三代测序具有体积小，便携且实验操作简单，测序片段较长，假阳性率较低，实验室要求较低等优点，故在有需求的医疗机构开展三代测序 mNGS 病原体检测 [58] ，可以缩短检测周期，同时发挥床旁实时监控测序的优势，有助于 HAP 患者的快速诊断和制定治疗方案。但由于其测序成本相对较高，故普及程度暂时不及二代测序。

4 结 语

在我国 HAP 的发生占医院获得性感染的首位，尤其是在重症监护病房(ICU)中发生率很高，因此抗菌药物的使用必须尽早且适当，这对 HAP 患者的临床结局至关重要。mNGS 病原检测对于 HAP 患者，尤其是ICU 患者而言，能减少其他尝试性药物使用过程带来的经济和时间成本，及时进行诊断可以改善预后，降低整体综合治疗费用。但由于呼吸道本身并非无菌状态，大量定植菌核酸的存在给 mNGS 病原检测结果的临床判读带来挑战，需要综合考虑临床情况以制定相应的治疗方案。

引用：中国医学救援协会重症医学分会.宏基因组学测序技术在成人医院获得性肺炎中的临床应用专家共识[J].中国急救复苏与灾害医学杂志,2023,18(5):561-568.

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